Sala del Consiglio. Il Doge è seduto sul trono, con i Consiglieri riuniti, e chiede la pace con Venezia. Da fuori si ode un tumulto e si vede Gabriele Adorno inseguito dalla folla e lotte tra popolo e patrizi; Boccanegra fa aprire le porte e la situazione si calma. Gabriele ha ucciso Lorenzino per il rapimento di Amelia ed accusa il Doge di essere il mandante, tenta quindi di assassinarlo ma Amelia gli fa scudo con il suo corpo. La donna racconta quindi l’accaduto e dice di essere stata liberata dopo aver minacciato la vendetta di Simone, ma il mandante è un’altra persona, presente in sala. A questo punto patrizi e plebei iniziano ad accusarsi a vicenda, il Doge riporta la pace (aria “Plebe, Patrizi, Popolo”) e chiede a Paolo di maledire con lui il traditore. L’uomo, atterrito e colpevole, è costretto a farlo.
Palazzo ducale. Gabriele e Fiesco vengono rinchiusi in carcere dopo la sommossa, Paolo li fa chiamare e chiede ad entrambi di uccidere il Doge. Nel frattempo però, per essere certo di non mancare la sua vendetta, versa del veleno nella tazza di Boccanegra. Il vecchio Fiesco rifiuta, così l’uomo cerca di convincere il giovane ragazzo innamorato dicendogli che Amelia vive a palazzo con il Doge, che la ama in modo torbido. Rimasto solo, Gabriele è accecato dalla gelosia ed accetta di compiere l’omicidio. Sopraggiunge Amelia, che confessa di amare anch’essa Simone ma di un amore puro del quale non può per il momento svelare il segreto. All’entrata del Doge la donna chiede pietà per l’amato, il padre acconsente se il giovane si ravvedrà. Rimasto solo e stanco Boccanegra beve un sorso dalla sua tazza, trovandone il contenuto amaro: “Perfin l’onda del fonte è amara al labbro dell’uom che regna…” Poi si addormenta. Gabriele irrompe per ucciderlo ma Amelia lo salva. Il Doge confessa quindi al ragazzo che Amelia è sua figlia. Il giovane si pente, rinunciando a vendicare la morte del proprio padre. Dall’esterno giungono rumori di una rivolta ed Adorno parte per difendere il Doge che, in cambio, gli promette la mano della figlia.
I Guelfi sono stati sconfitti, Fiesco è liberato. Paolo tratto a morte gli confessa di aver avvelenato il Doge e di aver fatto rapire Amelia. Il vecchio lo risparmia consegnandolo al patibolo. All’entrata del Doge egli si nasconde. L’uomo è sofferente e sente la morte venire, sentendo la voce di Fiesco lo riconosce sotto le spoglie di Grimaldi. Gli dice di meritare ora il suo perdono, poiché Amelia in realtà è la sua adorata nipote Maria. I due si riconciliano e si abbracciano. Al sopraggiungere dei novelli sposi, Simone annuncia alla ragazza che Fiesco è in realtà suo nonno; ma la gioia dei ritrovamenti è oscurata e minata dalla morte imminente di Boccanegra. L’uomo benedice la coppia e proclama Gabriele nuovo Doge. A Fiesco l’onere di annunciare al popolo l’ultima volontà e la morte del Doge.
