Nato in Sicilia nel 1921, si trasferì presto nella Milano Bene degli anni ‘40 dove iniziò a lavorare come cantante da bar e balera col nome di “Nino Florio”. Nome che abbandonò durante lo studio del canto, poiché usarlo sarebbe stato compromettente per la sua carriera.
Di Stefano visse in un periodo molto difficile per il nostro Paese tanto che, allo scoppio del secondo conflitto mondiale, partì per il servizio militare e smise di cantare. Tornò al canto perché nel reggimento un caporale lo sentì e lo congedò per farlo studiare.
Dopo aver fatto gavetta in bar e balere, intraprese stabilmente la carriera di cantante lirico debuttando con la Manon di Massenet nel 1946 a Reggio Emilia. Questo ruolo gli fui caro durante tutta la carriera e ancora oggi viene associato al grande tenore. Dal suo debutto in poi, Di Stefano bruciò tappe su tappe fino ad arrivare ad un repertorio vastissimo che metteva in evidenza le sue spigliatissime capacità canore. Una vastità di repertorio quasi ineguagliabile, che spaziava da Elisir d’amore a Rienzi, passando per la sua amata Tosca (nome anche dato alla figlia). Quella famosa Tosca che resta negli annali della discografia operistica, nella quale Di Stefano diede l’anima e delle sfumature al personaggio inarrivabili.